Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Erciyes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Klinik Öncesi Bilimler, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Şerife Dağlı
Danışman: Önder Düzlü
Özet:BEWO İNSAN TROPHOBLASTİK HÜCRE HATTINDA TOXOPLASMA GONDII'NİN TOLL-LIKE RESEPTÖRLERLE TANINMASI VE SİNYAL İLETİM YOLUNUN ARAŞTIRILMASI Şerife DAĞLI Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Parazitoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Danışman: Doç. Dr. Önder DÜZLÜ ÖZET Bu çalışma Bewo insan trophoblastik hücre hattında Toxoplasma gondii'nin toll-like reseptörlerle tanınması ve sinyal iletim yolunun araştırılması amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, BeWo hücre kültürü yapılmış, takizoitler ile enfeksiyon öncesi çoğalma işlemini gerçekleştirmek üzere HeLa hücre kültürü kullanılmıştır. Belirlenen sayıda takizoitlerle BeWo hücreleri enfekte edilmiştir. Enfeksiyon sonrası hücre kültüründen alınan örneklerin RNA izolasyonu yapılarak cDNA sentezlenmiştir. BeWo hücrelerinin çözdürülüp flaska ekilmesinnden sonraki ilk günde istenilen seviyede tutunma gerçekleşmediği için deney koşullarının sağlanması ve istenilen sayıda hücre sayısına ulaşılabilmesi amacıyla yıkama ve pasaj prosedürü üç hafta boyunca devam ettirilmiştir. Üst üste birikerek çoğalan hücreler üç günde bir pasajlanmış ve hızlı kontaminasyon nedeniyle her gün yıkanmıştır. Üçüncü haftanın sonunda, 25 cm2'lik flasklarda yaklaşık %80 doluluk görüldüğünde yaklaşık 1x106 Bewo hücresi olduğu belirlenmiştir. Optimal takizoit sayısı ve canlı hücre sayısını belirlemek üzere her gün parazit yoğunluğu invert mikroskopla gözlemlenmiş ve sayılmıştır. Enfeksiyonun en iyi gerçekleştiği BeWo hücrelerinin yoğunlukları 25 cm2 flasklarda 1x106 (~%80) hücre sayısı olarak belirlenip en uygun takizoit-hücre oranının ise 1:5 olduğu bulunmuştur. Gen ekspresyon seviyelerini belirlemek üzere kullanılan RNA örneklerinin nanodrop ölçümleri sonucunda; enfekte hücrelerde 720ng/µl kaliteli RNA olduğu tespit edilmiştir. Bu RNA örnekleri kullanılarak cDNA sentezlenmiş ve qPCR analizleri yapılmıştır. QPCR sonucunda elde edilen Cq değerleri ve deney için kontrol grubunu oluşturan HPRT1 referans geni kullanılarak gen ekspresyonlarındaki orantısal değişim hesaplanmıştır. Toll like reseptör paneli ile 84 adet gen incelenmiş olup bunlardan ACTB, B2M, GAPD, PGK, GUSB, PPIA, RPL13A olmak üzere yedisi 'house keeping' genlerden oluşmaktadır. Referans olarak alınan HPRT1geninin ekspresyon seviyesi temel alınarak program aracılığıyla hesaplanan ve enfeksiyona bağlı olarak gen ekspresyon seviyesinde kontrol grubuna göre anlamlı artış gözlemlenen genler; AKT3, CXCL12, PIK3CB, PIK3CD, PIK3R5, STAT1, CD40, IKBKE, IL1β, MAPK2, MAPK3, NFKB2, TLR1, TLR7 genleridir. İstatistiksel olarak AKT3, CXCL12, PIK3CB, PIK3CD, PIK3R5, STAT1, CD40, IKBKE, IL1β, MAPK2, MAPK3, NFKB2, TLR1, TLR7 genlerinin ekspresyon seviyelerinde anlamlı artış olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile; toll like reseptörlerin sinyal iletim yolunun araştırılması üzerine in vivo şartlarda qPCR kullanarak toll like reseptör yolağı incelenmiş, TLR1 ve TLR7'nin ekspresyon seviyelerinde artış olduğu ve AKT3, CXCL12, PIK3CB, PIK3CD, PIK3R5, STAT1, CD40, IKBKE, IL1β, MAPK2, MAPK3, NFKB2 genlerinin ekspresyon seviyelerinde arttığı gözlemlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Toxoplasma gondii, BeWo hücre hattı, Toll-like reseptör