Babesia bigemina Kayseri/Türkiye Suşlarının Apical Membrane Antigen-1 (AMA-1) Proteininin Moleküler Genotiplendirilmesi, Ekspresyonu ve İmmunolojik Karakterizasyonu
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Arif Çiloğlu
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Abdullah İNCİ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma, in vivo ve in vitro kültivasyonu yapılmış ve pasajlanmış (in vivo: 1. pasaj; in vitro: 1. pasaj) olan "Babesia bigemina Kayseri/Türkiye" suşlarının AMA-1 proteinlerinin moleküler genotiplendirilmesi, ekspresyonu ile immunolojik karakterizasyonunu belirlemek, söz konusu proteinin attenüasyona bağlı poliformizm gösterip göstermediğini ortaya koymak ve yeni aşıların geliştirilmesinde hedef protein olarak güvenilirliğini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, %4,1 ve %11 parazitemiye sahip suşlardan; AMA-1 gen bölgesini kodlayan nükleotid dizilimlerinin belirlenmesi, belirlenen nükleotid dizilimlerinin intron içerip içermediğinin tespiti ve elde edilen sekansların ekspresyon analizleri öncesinde açık okuma çerçevesi [open reading frame (ORF)] veri tabanında değerlendirilmesi amacıyla genomik DNA (gDNA) izolasyonu yapılmıştır. Elde edilen gDNA izolatları, B. bigemina AMA-1 (BbigAMA-1) geninin tamamını amplifiye eden spesifik primerler ile PCR analizine tabii tutulmuştur. PCR sonrasında BbigAMA-1 geni pJET1.2/blunt vektörüne klonlanmıştır. Elde edilen rekombinant plazmidler sekanslanarak GenBank'a kaydedilmiş (KP000032-33) ve Dünyadaki diğer BbigAMA-1 izolatları ile çoklu ve ikili hizalamaları yapılarak filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon analizleri öncesinde elde edilen nükleotid ve amino asit dizileri ORF veri tabanında değerlendirilmiş ve ekspresyon analizleri için yeni primerler dizayn edilmiştir. Daha sonra, aynı suşlar ekspresyon analizleri için RNA ekstraksiyonuna tabii tutulmuş ve takiben revers transkripsiyon ile cDNA sentezi yapılmıştır. Sentezlenen cDNA'lar, BbigAMA-1 fragmentleri için dizayn edilen primerler ile tekrar PCR analizine tabii tutulmuş ve sonrasında elde edilen ürünler ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama sonrasında rekombinant plazmidler E. coli BL21 (DE3) hücrelerine tranforme edilmiş ve IPTG ile indüklenerek rekombinant BbigAMA-1 genlerinin ekspresyonu sağlanmıştır. Ekspresyon ürünlerinde hedef protein bandı SDS-PAGE ve Western Blot teknikleri ile analiz edilmiş ve BbigAMA-1'in her iki suş için de moleküler ağırlıkları hesaplanmıştır. Nükleotid dizilimlerinin çoklu ve ikili hizalamalar ile filogenetik analizler sonucu Kayseri/Turkey IV1 ve Kayseri/Turkey IT2 suşları kendi aralarında %99,77 identiklik gösterirken her iki suş en yüksek identikliği GenBank'a kayıtlı "Turkey" suşu (GenBank aksesyon no: JN572801) ile göstermiştir. Aynı izolatların amino asit dizilimlerinin ikili hizalamaları yapıldığında benzerlik oranı %99,83 olarak belirlenmiş ve elde edilen bu oranın, nükleotid sekans dizilimlerinin 103. nükleotidlerindeki mutasyondan ileri geldiği tespit edilmiştir. Bunun yanında, SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile söz konusu iki suşun 72 kDa moleküler ağırlıklarla farklı zaman dilimlerinde eksprese oldukları da belirlenmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, AMA-1'in B. bigemina için uygun bir aşı adayı hedef protein olup olmadığı noktasında tartışmalı olduğunu ve hususun aydınlığa kavuşması için Türkiye'ye özgü çok sayıda homolog suşa ait BbigAMA-1 proteinin in vivo ve in vitro ortamlarda immun reaksiyon denemelerine tabii tutulması gerektiğini göstermiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile B. bigemina'nın iki farklı pasajında yer alan hedef AMA-1 proteinlerinin moleküler karakterizasyon ve ekspresiyonları karşılaştırmalı olarak ilk defa yapılmış ve iki suş arasında mutasyonel farklılıkları gösteren attenüasyona bağlı polimorfik alanlar tespit edilmiştir.