Pichia pastoris maya ekspresyon sisteminde Varicellovirus bovinealpha-1 glikoprotein E'nin rekombinant olarak üretimi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, VETERİNERLİK MİKROBİYOLOJİSİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2026
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SERVET MERVE BÜYÜKCERAN
Danışman: AYŞE GENÇAY GÖKSU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Varicellovirus bovinealpha1 (BoAHV-1), sığırlarda solunum ve genital sistem hastalıklarına neden olan, süt üretiminde azalma ve abortlar dahil olmak üzere ciddi ekonomik kayıplara yol açan bulaşıcı bir virus ajanıdır. Glikoprotein E, herpesvirusların immun tepkilerinden kaçmasını ve özellikle sinir dokusu içinde hücreden hücreye verimli bir şekilde yayılmasını sağlayan önemli bir virülans faktörüdür. Bu çalışmada amaç, Pichia pastoris kullanılarak bir maya ekspresyon sisteminde gE glikoproteinini üretmek ve karakterize etmektir. BoAHV-1 izolatı (Kayseri, 2024), MDBK hücre hattında çoğaltılmıştır. Antijenik olarak zengin epitop bölgeleri içeren 210 amino asidi kodlayan kısmi gE gen bölgesi, primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. Primerlerin 5' uçlarına, pPICZαA vektöründe bulunan EcoRI ve XbaI kısıtlama enzim bölgeleri eklendi. Elde edilen PCR ürünü, T4 DNA ligaz enzimi kullanılarak vektöre bağlandı ve rekombinant pPICZAα-gE oluşturuldu. Rekombinant plazmid, Escherichia coli DH5α hücrelerinde çoğaltıldı ve saflaştırıldı. Ardından elektroporasyon yoluyla Pichia pastoris GS115'e aktarıldı. Dönüştürülen hücrelerin seçimi, Zeosin antibiyotiği içeren seçici YPD-Sorbitol ortamında gerçekleştirildi. Pozitif kolonilerin zenginleştirilmesinin ardından indüksiyon 96 saat boyunca %1 metanol ile yapıldı. Kültür süpernatantında salgılanan gE, His-etiket affinite reçinesi ile saflaştırıldı. Saflaştırma sonrası protein konsantrasyonu 1,25 mg/mL olarak tespit edildi. SDS-PAGE analizinde yaklaşık 35 kDa moleküler ağırlığa sahip bir proteinin varlığı gözlemlendi ve spesifik ürün, HRP konjugeli 6x-His Tag monoklonal antikoru kullanılarak Western blot analizi ile doğrulandı. Sonuç olarak, protein ekspresyonu için Pichia pastoris sisteminde gE başarıyla ifade edildi ve bu sistemin viral glikoproteinlerin rekombinant üretimi için uygun bir model olarak hizmet edebileceği gösterildi. Elde edilen proteinin ileri tanı ve immünolojik araştırmalarda kullanılabileceği değerlendirildi. Anahtar Kelimeler: E glikoproteini; Pichia pastoris; Rekombinant Ekspresyon; Varicellovirus bovinealpha1