Hypoderma bovis Hypodermin Rekombinant Antijenlerinin Karakterizasyonu Ekspresyon Profilleri ve Serolojik Teşhisteki Etkinliklerinin Değerlendirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Erciyes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Klinik Öncesi Bilimler, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Mübeccel OKUR
Eş Danışman: Alparslan Yıldırım
Danışman: Abdullah İnci
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışmada, sığırlarda enfestasyona yol açan Hypoderma bovis larvalarının vücutta göçü sırasında salgıladıkları ve immun modülasyonda aktif görev alan önemli serin proteazları hypodermin A (HA), hypodermin B (HB) ve hypodermin C (HC)'nin moleküler karakterizasyonları sonrası rekombinant olarak elde edilmesi ile hypodermosis'in serolojik teşhisinde önemli antijenler olarak kullanılabilecekleri hipotez edilmiştir. Çalışmada rekombinant antijenler ve ilgili genlerin aminoasit sekanslarından dizayn edilen peptidler ile Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) metodolojisi geliştirilmiş ve etkinlikleri değerlendirilerek saha sığır serum örneklerinde hypodermosis'in seroprevalansı araştırılmıştır. Araştırma materyalini mezbaha incelemelerinde hypodermosis ile enfeste belirlenen sığırlardan toplanmış üçüncü dönem (L3) Hypoderma larvaları oluşturmuştur. Kesimden önce enfeste hayvanlardan tam kan örnekleri alınarak serumlar elde edilmiştir. Larvalardan genomik Deoksiribo Nükleik Asit (DNA) ve total Ribo Nükleik Asit (RNA) izolasyonları gerçekleştirilmiş ve takiben Komplementer DNA (cDNA) sentezi yapılmıştır. Morfolojik teşhis sonrasında incelenen larvaların mitokondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) DNA barkod bölgesinin sekans karakterizasyonuyla H. bovis'e ait oldukları konfirme edilmiştir. Hypoderma bovis cDNA kütüphanelerinde hypodermin genleri dizayn edilen spesifik primerlerle amplifiye edilmiştir. Nükleotid ve amino asit sekanslarının elde edilmesi amacıyla amplikonlar uygun bakteriyel plazmidlere klonlanarak transformasyon basamaklarından sonra rekombinant plazmid pürifikasyonu yapılmıştır. Rekombinant plazmidler çift yönlü olarak sekanslanmış ve genetik yazılımlarla sekanslar işlenerek her gen bölgesi için konsensus sekanslar elde edilmiştir. HA, HB ve HC genlerine ait Açık Okuma Çerçevesi (ORF) sekanslarının sırasıyla 705 baz çifti (bp), 771 bp, 783 bp uzunluğunda oldukları ve 234 amino asit (aa), 256 aa ve 260 aa uzunluğunda proteinleri kodladıkları belirlenmiştir. Her üç hypodermin geninde intraspesifik nükleotid farklılığı belirlenmezken interspesifik nükleotid farklılıkları HA ve HB arasında %29,5, HA ve HC arasında %57,9, HB ve HC arasında %53,9 olarak tespit edilmiştir. In-silico analizlerde H. bovis HA, HB ve HC genlerinin sırasıyla 25,744 kilodalton (kDa), 27,795 kDa ve 28,516 kDa büyüklüğünde proteini eksprese ettikleri belirlenmiştir. Sonraki basamakta bakteriyel ekspresyon sistemine klonlanan hypodermin genleri üzerinde ekspresyon çalışmaları yürütülmüş ve ekspresyon etkinliği Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) ve Western Blot analizleri ile belirlenmiştir. HA'nın Escherichia coli ekspresyon sisteminde ifade olmadığı belirlenmiş, pürifiye edilmiş rekombinant HB (rHB) ve HC (rHC) antijenlerinin ise pozitif sığır serum dilüsyonları ile yapılan Western Blot analizlerinde immun reaktivite gösterdikleri saptanmış ve protein büyüklükleri in-silico sonuçlara paralellik göstermiştir. Pürifiye rHB, rHC ve peptidler (pHA, pHB, pHC) üzerinde yürütülen standardizasyon çalışmalarında ELISA için rHC antijeni ve pHC peptidinin en etkin ve birbirine benzer sonuçları verdiği belirlenmiştir. rHC ve pHC ile oluşturulan ELISA'da incelemesi yapılan 200 sığırda hypodermosis seroprevalansı %62,0 olarak belirlenmiş ve enfestasyonun dağılımında yaş, cinsiyet ve ırk gibi çeşitli parametrelerin etkisi değerlendirilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile sığırların önemli bir ekto-endoparaziti ve yüksek ekonomik kayıplara yol açan H. bovis için antijenik değeri yüksek ve immun modülasyonda aktif görev alan HA, HB ve HC proteinlerini kodlayan genlerin dünyada ilk kez moleküler karakterizasyon verileri sağlanmış, immun reaktiviteleri üzerine özgün çıktılar elde edilmiş ve hypodermosis'in serolojik teşhisi amacıyla rekombinant teknolojisi ile özgün rekombinant antijenler elde edilmiş ve ELISA metodolojisi geliştirilmiştir. Anahtar kelimeler: Ekspresyon, Hypoderma bovis, hypodermin A, hypodermin B, hypodermin C, moleküler karakterizasyon, ELISA, sığır