Development of Antigen ELISA for Detecting Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus from Tick Samples


Creative Commons License

Çanakoğlu N., Berber E.

14. Ulusal Veteriner Mikrobiyoloji Kongresi, Uluslararası katılımlı. , Konya, Turkey, 13 - 16 October 2020, pp.65-66

  • Publication Type: Conference Paper / Summary Text
  • City: Konya
  • Country: Turkey
  • Page Numbers: pp.65-66

Abstract

Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is an emerging zoonotic disease prevlent in Asia, Europe and Africa. Causative agent is replaced in genus Orthonairovirus and transmitted primarily through ticks. Especially Hyalomma marginatum is the primary vector for transmitting the disease. Evaluating the virus circulation in endemic areas is crucial for understanding the epidemiological aspects and geographical distrubition of disease. In this study we aimed to develop an antigen ELISA method for detecting CCHF virus from collected tick samples. For this purpose inactive CCHF-Turkey-Kelkit/08 have been used for rabbit immunization and polyclonal sera have been collected. Serum samples used in ELISA for detecting the serum antibody titers. Highest titer of antibody have been purified by using protein A/G column and used as capturing antibody. Anti CCHFV-NP monoklonal antibodies have been used for detecting antibodies. Freze-thawed tick samples which have been collected from endemic areas are used for validation and standardization of antigen ELISA. Positive and negative tick samples have been determined by using commercial ELISA kit (VectorBest, Russia) and also confirmed by PCR. Total 58 positive, 65 negative samples tested with newly developed antigen ELISA. Specifity and sensitivity of test have been measured %99 and %92 respectively. Positive tick samples have been tested with real-time PCR and results normalised both ΔCt and copy number. Detection limit of developed antigen ELISA have been measured as 3.2 x 104 copy number. In this study a cheap and reliable antigen ELISA have been developed for diagnosis of CCHF virus in field.

Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKAH) Asya, Avrupa ve Afrika kıtasından yaygın olarak görülen ve ölümlere sebep olan zoonotik bir hastalıktır. Hastalığa neden olan etken Orthonairovirus genusunda yer almakta olup keneler primer bulaş kaynağı olarak rol oynamaktadır. Özellikle Hyalomma marginatum cinsi keneler hastalığın yayılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Endemik bölgelerde kene popülasyonlarında virüs sirkülasyonunun saptanması hastalığın epidemiyolojisinde ve coğrafi dağılımının belirlenmesinde oldukça kritiktir. Bu çalışmada KKKAH virüsünün kene örneklerinde saptanması amacı ile antijen ELISA testi geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla inaktif KKKA-Turkey/Kelkit/08 suşu ile tavşanlara poliklonal serum elde etmek amacı ile ikişer hafta aralıklarla dört kez immunizasyon yapılmış ve toplanan serumların titresi ELISA ile belirlenmiştir. En yüksek titredeki serumlar protein A/G affinite kolonlarından pürifiye edilmiş ve yakalayıcı antikor olarak kullanılmak üzere standardize edilmiştir. Detektör antikor olarak KKKATurkey/Kelkit/08 suşu NP proteinine karşı geliştirilmiş monoklonal antikor kullanılmıştır. Testin standardizasyonu ve validasyonu amacıyla endemik bölgelerden toplanan kene örnekleri dondur-çöz işleminden sonra PBS içerisinde sulandırılarak ticari kit (VectorBest, Rusya) ile pozitif ve negatif örnekler belirlendikten sonra PZR ile doğrulamaları yapılmış 58 pozitif 65 negatif örnek geliştirilen antijen ELISA ile test edilmiştir. Testin özgüllüğü %99, duyarlılığı %92 olarak belirlenmiştir. Testin deteksiyon limitinin belirlenmesi amacı ile pozitif kene örnekleri real-time PZR ile test edilmiş ve sonuçlar ΔCt ve kopya sayısı olarak karşılaştırılmıştır. Sonuçlara göre testin deteksiyon limiti 3.2 x 104 olarak belirlenmiştir. Çalışma neticesinde sahadan kene örneklerinde KKKAH virüsünün kolaylıkla saptanabilmesi için ucuz ve güvenilir bir test geliştirilmiştir.