Ichthyophthirius multifiliis Türkiye Suşlarının Aşı Adayı Immobilizan Antijenlerini Kodlayan Genlerin Klonlanması, Gen Ekspresyonu ve Karakterizasyonu


Creative Commons License

Yıldırım A. , Pekmezci G. Z. , Şimşek E. , Balta F., Düzlü Ö. , Önder Z. , ...Daha Fazla

21. Parazitoloji Kongresi , İzmir, Türkiye, 28 Eylül - 03 Ekim 2019, ss.241-242

  • Basıldığı Şehir: İzmir
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.241-242

Özet

Bu çalışmada, Gökkuşağı alabalıklarında enfeksiyon oluşturan Ichthyophthirius multifiliis’in farklı bölgelerden izole edilmiş saha suşlarının genotipik yapıları temelinde immundominant özellik gösteren rekombinant immobilizan antijenlerini (i-antijen) kodlayan genlerin bakteriyel ekspresyon sistemine klonlanarak eksprese ve karakterize edilmeleri, antijenik profillerinin ortaya çıkarılması ve aşı adayı olabilecek rekombinant antijenlerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada 2018 ve 2019 yıllarının Temmuz ve Ağustos ayları arasında Gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğinin yoğun yapıldığı Samsun, Rize, Kayseri, Elazığ, Burdur, Antalya ve Muğla illerinde bulunan işletmeler ziyaret edilerek balık popülasyonları üzerinde saha araştırmaları yürütülmüş ve I. multifiliis ile enfekte bulunan balıklardan ilgili protokollere göre izolasyon gerçekleştirilmiştir. Laboratuvara uygun solüsyonlar ve soğuk zincir altında intikal ettirilen örneklerden cDNA ve gDNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. I. multifiliis i-antijen gen lokusunun amplifikasyonu amacıyla optimum primer dizaynı için ön çalışmalar yürütülmüş ve hedef gen bölgeleri uygun amplifikasyon koşullarında PCR’da çoğaltılmıştır. Elde edilen amplikonlar agaroz jel üzerinden saflaştırılmıştır. Multiple gen lokusu sekanslarının belirlenebilmesi amacıyla ilgili pürifiye amplikonlar pJET 1.2 plazmit vektörüne CloneJET PCR cloning kit (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak klonlanmış ve katı besi yerinde belirlenen kolonilerden rekombinant plazmid DNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Rekombinant plazmidler spesifik primerlerle çift yönlü olarak sekanslanmış ve kromotogramlar De Novo Assemble üzerinden işlenerek hedef insert sekanslar vektör plazmid DNA’sı içerisinden çıkarılmış ve konsensüs sekanslar elde edilmiştir. İlgili primerlerin i-antijen gen lokusu içerisinde çoğalttığı fragmentlerin belirlenebilmesi amacıyla PCR ürünleri ayrıca yeni nesil dizileme teknolojisi (NGS) kullanılarak işlenmiş ve elde edilen dizilimlerin gen veri tabanlarındaki mevcut tüm i-antijen gen lokusları ile filogenetik ilişkileri araştırılmıştır. Tüm bu araştırmalar sonucu karakterize edilen i-antijen genlerinin eksprese ettiği proteinlerin rekombinant olarak eldesi için çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Aşı adayı potansiyeli olabilecek bazı lokusların bakteriyel ekspresyon sistemine aktarımı için kodon optimizasyonları yapılarak pET-32a(+) ekspresyon plazmid DNA’sına (Novagen) klonlanması gerçekleştirilmiştir. Elde edilen rekombinant plazmitler E. coli kompotent BL21(DE3) hücrelerine transforme edilerek optimum koşullarda ekspresyon çalışmaları yürütülmüş ve ekspresyon etkinliği SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile belirlenmiştir. Eksprese edilen rekombinant i-antijen proteinleri afinite kromotografi kulanılarak saflaştırılmış ve immun reaktiflikleri Western Blot analizleri ile tespit edilmiştir. Çalışmada, Elazığ, Rize ve Muğla illerinde ziyaret edilen işletmelerdeki Gökkuşağı alabalıklarında deri ve solungaçlarından hazırlanan preparatların mikroskobik incelemeleri ile I. multifiliis enfeksiyonunun yaygın olduğu görülmüştür. İlgili bölgelerden elde edilen I. multifiliis suşlarına ait cDNA ve gDNA izolatlarının i-antijen gen lokusunun dizayn edilen pirmerlerle PCR’da amplifiye edilmesi sonucu 1200-1300 bp büyüklüğünde amplikonlar saptanmıştır. Pürifiye amplikonların klonlanması sonucu ilgili izolatlara ait açık okuma çerçevesi (ORF) sekanslarının analizinde birbirleriyle %38,3-58,8 arasında farklılık gösteren 4 farklı i-antijen izoformu tespit edilmiştir. Bu izoformlar arasında bir antijenik lokusun (ImulTR1-iant) her üç ildeki alabalık popülasyonlarından izole edilen I. multifiliis suşlarında da var olduğu NGS analizlerinde görülmüştür. ImulTR1-iant ORF sekansı ayrıca Amerika Birleşik Devletleri’nde alabalıklardan izole edilmiş bir i-antijen izoformuyla %83,3 identiklik gösterirken, diğer tespit edilen izoformlara ait sekansların GenBank veri tabanında mevcut i-antijen sekanslarından oldukça farklı olduğu belirlenmiştir. Araştırmada rekaombinant i-antijen eldesi için yaygın belirlenen ImulTR1-iant izolatı üzerinden analizler yürütülmüştür. Bu izoformu kodlayan gen bölgesinin 1263bp büyüklüğünde olduğu ve ORF’nin 420 amino asitten teşekkül ettiği belirlenmiştir. ORF amino asit sekanslarının in-slico analizlerde 42,552 kDa büyüklüğünde bir proteini eksprese ettiği, bu proteinin sitoplazmik olduğu ve transmembran bölge içermediği tespit edilmiştir. Ayrıca ilgili ORF sekansı içerisinde uzunluğu 7-22aa arasında değişen 21 antijenik bölge olduğu belirlenmiştir. Kodon optimizasyonu yapılmış olan ImulTR1-iant izoformuna ait pET-32a(+) rekombinant plazmitinin E. coli kompotent BL21(DE3) hücrelerine transformasyonu ve ekspresyonu sonrasında yapılan SDS-PAGE analizlerinde in-silico analiz sonuçlarına paralel olarak yaklaşık 43kDa’luk protein jel üzerinde görüntülenmiştir. İlgili rekombinant protein afinite kromotografide HisTrap FF crude (GE Healthcare) kolonları kullanılarak saflaştırılmış ve pürifiye rekombinant antijenin immun-reaktifliği Western-Blot analizleriyle gösterilmiştir. Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TOA-2017-7742 kod numarasıyla desteklenen bu çalışma ile Türkiye’de gökkuşağı alabalıklarında sorun oluşturan ve ekonomik kayıplara yol açan I. multifiliis suşlarına karşı biyoteknolojik aşı geliştirilmesi noktasında aşı adayı olabilecek immobilizan antijenler üzerine özgün veriler sağlanmıştır. Elde edilen aşı adayı rekombinant antijenlerin etkinliğini ortaya koyma noktasında laboratuvar ve saha şartlarında immunizasyon ve çelınç enfeksiyon denemeleri için yeni proje çalışmaları planlanmaktadır.