Lösemi Alt Tiplerinde MUTYH/NTHL1-Bagımlı DNA Tamiri ve Olaparib- Decitabine Yanıtının Fonksiyonel Incelenmesi
MEHMETBEYOĞLU DUMAN S. E. (Yürütücü), MANDACI ŞANLI N., ÇINAR V., HAPİL ZEVKLİLER F. Z., TAHERİ S.
TÜBİTAK Projesi, 3501 - Ulusal Genç Araştırmacı Kariyer Geliştirme Programı, 2026 - 2029
- Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
- Destek Programı: 3501 - Ulusal Genç Araştırmacı Kariyer Geliştirme Programı
- Başlama Tarihi: Temmuz 2026
- Bitiş Tarihi: Ocak 2029
Proje Özeti
Akut miyeloid lösemi (AML) ve akut lenfoblastik lösemi (ALL), hematopoietik hücrelerde gelişen genetik ve epigenetik bozukluklar sonucunda ortaya çıkan iki farklı lösemi grubudur. Bu hastalıkların biyolojisini belirleyen temel unsurlardan biri, DNA hasarı yanıtı ve DNA tamir mekanizmalarındaki farklılıklardır. Doktora tez çalışmam kapsamında gerçekleştirilen tüm genom dizileme analizleri, AML ve ALL modelleri arasında SBS30 mutasyonel imzası açısından belirgin bir fark bulunduğunu ortaya koymuştur. Bu imzanın özellikle baz eksizyon tamir (BER) yoluna ait MUTYH ve NTHL1 genleri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Elde edilen bu bulgular, AML ve ALL alt tiplerinin DNA tamir mekanizmalarına olan bağımlılıklarının farklı olabileceğini ve MUTYH/NTHL1 eksikliğinin tedavi yanıtlarını belirleyici şekilde etkileyebileceğini düşündürmektedir.
Bu proje, söz konusu genomik gözlemleri mutasyonel imza analizlerini tekrar etmeksizin, doğrudan fonksiyonel deneylerle test etmeyi amaçlamaktadır. Projenin temel hedefi, AML ve ALL hücre alt tiplerinde MUTYH ve NTHL1 genlerinin fonksiyonel kaybının, DNA hasarı birikimi, BER kapasitesi ve klinikte aktif olarak kullanılan iki önemli ajan olan Olaparib (PARP inhibitörü; FDA onaylı hedefe yönelik tedavi) ve Decitabine (DNMT inhibitörü; hipometilasyon tedavisinde standart ajan) karşısındaki ilaç duyarlılığı üzerindeki etkilerini ortaya koymaktır.
PARP inhibitörleri, özellikle DNA tek zincir kırıklarının PARP1 aracılı tamirini engelleyerek DNA hasarını artırmakta ve BER yolundaki kusurları daha belirgin hâle getirmektedir. Bu nedenle, BER yolunun iki kritik enzimi olan MUTYH ve NTHL1’in kaybı, lösemi hücrelerinin PARP inhibisyonuna karşı duyarlılığını anlamlı düzeyde artırabilir. Benzer şekilde, Decitabine DNA’ya entegre olarak replikatif stres ve DNA hasarı oluşturan bir DNMT inhibitörüdür ve bu süreçte BER yolaklarını ikincil olarak zorladığı gösterilmiştir. Dolayısıyla MUTYH/NTHL1 kaybının, Decitabine’e karşı hücresel yanıtı da kökten değiştirmesi beklenmektedir. Bu biyolojik çerçevede proje, BER temelli yeni terapötik zafiyetlerin tanımlanmasına katkı sunmayı hedeflemektedir.
Bu amaçla, bir AML ve bir ALL hücre hattında CRISPR-Cas9 teknolojisi kullanılarak MUTYH-knockout (KO) ve NTHL1-KO modelleri oluşturulacaktır. Knockout doğrulaması protein düzeyinde Western blot yöntemi ile yapılacaktır. KO doğrulamasının ardından, WT, MUTYH-KO ve NTHL1-KO alt hatları kullanılarak temel DNA hasarı ve DNA tamir parametreleri değerlendirilecektir. Bazal DNA hasarı, çift zincir kırıklarının erken göstergesi olarak γH2AX Western blot analizleri ile ölçülecek; oksidatif stres yanıtı ise oksidatif DNA hasarının önemli bir göstergesi olan 8-oxo-dG düzeylerinin ELISA tabanlı kantifikasyonu ile belirlenecektir. Ayrıca BER fonksiyonu, MUTYH ve NTHL1 protein düzeylerinin Western blot ile değerlendirilmesi ve hedef bölgelere yönelik qPCR tabanlı BER aktivite analizleri ile ölçülecektir.
İlaç deneylerinde, Olaparib ile 24, 48 ve 72 saatlik tek ajan uygulamaları gerçekleştirilecektir. Bu zaman noktaları, PARP inhibisyonuna bağlı DNA hasarı birikiminin zamana bağlı olarak değerlendirilmesini ve kısa–orta–uzun süreli hücresel yanıtların karşılaştırılmasını mümkün kılmaktadır. Decitabine ise, kısa yarı ömrü ve klinikteki kullanımına paralel olarak 72 saatlik düşük doz rejimi ile uygulanacaktır. Yüksek dozların yol açtığı non-spesifik sitotoksisite nedeniyle düşük doz uygulama, gerçek epigenetik etkilerin değerlendirilmesi açısından daha anlamlıdır. Her iki ilaç için hücre canlılığı (CellTiter-Glo), apoptoz (Annexin V/PI akım sitometrisi) ve DNA hasarı (γH2AX Western blot) analizleri WT ve KO hücreler arasında karşılaştırılacaktır. Oksidatif stres altında BER yetkinliğinin değerlendirilmesi amacıyla hücreler belirli konsantrasyonlarda H₂O₂ ile muamele edilecek; bu koşullar altında γH2AX, ROS ve 8-oxoG düzeylerindeki değişimler analiz edilerek WT ve KO hücrelerin DNA tamir kapasiteleri karşılaştırılacaktır.
Ek olarak, klinik çalışmalarda etkinliği gösterilmiş olan Decitabine → Olaparib sekansiyel tedavi modeli uygulanarak MUTYH/NTHL1 eksikliğinin bu kombinasyon altında sentetik zafiyet oluşturup oluşturmadığı test edilecektir. Özellikle BER kusurlu AML alt tiplerinde bu etkinin daha belirgin olması beklenmektedir.
Bu projeden elde edilecek bulgular, MUTYH ve NTHL1 genlerinin lösemi alt tiplerinde DNA tamir yükü, oksidatif stres yanıtı ve ilaç duyarlılığı üzerindeki belirleyici rollerini ortaya koyacaktır. Ayrıca, PARP ve DNMT inhibitörlerinin hangi lösemi alt tiplerinde daha etkili olabileceğine dair yeni biyobelirteçlerin tanımlanmasına katkı sağlayacaktır. Maliyet açısından uygulanabilir olması ve ülkemizde ilk kez MUTYH/NTHL1 ekseninin AML–ALL alt tiplerinde fonksiyonel düzeyde karşılaştırılması nedeniyle proje yüksek özgünlük taşımaktadır.